Produção de proteínas heterólogas em microalga

Resumo Microalgas são um sistema atrativo para expressão de proteínas recombinantes por sua facilidade de produção em larga escala e baixo custo de cultivo. Microalgas quando usadas em estratégias de secreção de proteínas alvo são especialmente interessantes pois o processo de secreção permite: ● separar e purificar a proteína alvo de uma matriz simples, impactando custo e qualidade; ● cultivar as células com perfusão, aumentando produtividade e reduzindo tamanho de unidades de processamento; ● usar certos maquinários moleculares para modificações pós-traducionais, como glicosilação. Apesar de todas as vantagens listadas, nós identificamos pelo menos duas lacunas relacionadas ao desenvolvimento dessa plataforma de expressão: (1) estudos com peptídeo sinal (PS) são escassos, não permitindo escolha de PS com maior eficiência de secreção e normalmente obtêm baixos rendimentos (2) fotobiorreatores de escala laboratorial comerciais, não permitem paralelização de experimentos por seu custo proibitivo, reduzindo velocidade de desenvolvimento Para reduzir essas lacunas o trabalho foi organizado em duas partes: ● melhoramento das ferramentas moleculares, com avaliação de 7 proteínas fluorescentes (PF) como repórteres de secreção em Chlamydomonas reinhardtii e avaliação de 10 PSs, ● desenvolvimento de equipamentos de baixo custo para cultivo de microalgas recombinantes Realizado de forma a permitir comparação direta entre os PSs e cultivo da cepa recombinante em condições de alta produtividade (fotobiorreator), o trabalho objetivou obter alto rendimento de secreção pelas cepas recombinantes. Apesar do sucesso na secreção das 7 proteínas fluorescentes (ciano: mCerulean; verde: GFP e Emerald; laranja: cOFP, tdTomato; e vermelho mCherry), a eficiência de cada PF como repórter foi influenciada por sua região de fotoatividade. Os resultados sugerem que na região do laranja e vermelho há uma menor interferência pelos pigmentos celulares, já que elevadas relações sinal ruído (SN = 7,7 – 16,0) foram obtidas nessa região. Além disso, essas PFs apresentaram alta frequência de colônias positivas (>75%), com exceção da tdTomato (<9%). A mCherry foi escolhida para ser fusionada aos PSs selecionados para o estudo, 4 obtidos na literatura ( binding protein 1 – BiP1; arilsulfatase 1 – ARS1, anidrase carbônica 1 – CAH1], e ice-binding protein 1 – IBP1) e 6 de 2221 novos PSs previstos pelo software SignalP 4.0. Os peptídeos sinais com maior eficiência de secreção foram PS 5 e 7, ambos novos, com aumento de pelo menos 25% na capacidade de secreção de mCherry frente ao melhor peptídeo dos descritos na literatura (ARS1). Para estender a avaliação, o peptídeo sinal PS 5foi utilizado para secretar hialuronidase, um biofármaco, obtendo colônias com atividade hialuronidásica no sobrenadante. Na última parte do trabalho, foi desenvolvido o fotobiorreator tubular fechado, para cultivo dos organismos geneticamente modificados, que alcançou produtividade de 10 mg/L.d de mCherry, com velocidade máxima de crescimento de 1,27 d -1 , a uma fração dos custo das alternativas comerciais. Os resultados e recursos gerados nesse trabalho, fomentarão o desenvolvimento de bioprocessos para a produção de proteínas por microalgas recombinantes, por identificar peptídeos sinais mais eficientes, identificar as PFs úteis como repórteres e demonstrar a viabilidade da construção de fotobiorreatores esterilizáveis em escala laboratorial. PRODUÇÃO INTELECTUAL Artigos publicados em periódicos Molino JVD , de Carvalho JCM, Mayfield S. Evaluation of secretion reporters to microalgae biotechnology: blue to red fluorescent proteins. Algal Research. 2018. 31: 252–261. DOI:10.1016/j.algal.2018.02.018 Molino JVD, de Carvalho JCM, Mayfield S. Comparison of secretory signal peptides for heterologous protein expression in microalgae: Expanding the secretion portfolio for Chlamydomonas reinhardtii . PLoS ONE. 2018. 13(2): e0192433. https://doi.org/10.1371/ Molino JVD , et al. Chimeric spider silk production in microalgae: a modular bionanomaterial. 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